结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是一种发源于结肠或直肠的癌症，时常始于良性息肉，并牢固演变为恶性肿瘤。它具有高度的遗传异质性，波及多种基因突变（如APC、KRAS、TP53等）体育游戏app平台，这些突变共同促进了肿瘤的发展和扩散。值得提神的是，CRC并不是单一类型，而是不错左证基因抒发的不同模式（即基因抒发谱）进一步细分为多个分子亚型。每个亚型齐有其特有的基因变异和抒发特征，这导致它们在生物学行径、疾病证据以及对调养的反馈方面存在显耀各异。尽管当今概括性调养可使晚期患者的中位总生计期达到30个月，但举座厌世率依旧较高。为了更好地领会各分子亚型的特色并设备更有用的调养计谋，研讨东说念主员诈欺从患者手术切除的原发性CRC组织构建类器官模子，以模拟体内环境，进行高通量药物筛选来识别针对特定亚型的有用疗法。

小恒本期则主要整理CRC类器官的构建要领，供世界学习参考。

CRC是由大肠内名义上皮细胞的恶性一样引起，培养的CRC类器官骨子即是癌变的肠上皮组织，与往往结肠类器官的培养容貌相似。另外，针对往往结肠组织类器官的培养基只需稍加修改即可适用于CRC类器官的扩增（表1）[1]。与往往结肠类器官不同的是，跳跃94%的CRC病例中WNT/β-catenin已被握续性激活，因此Wnt3A条目培养基对于CRC类器官来说不是必要的，何况WNT信号的缺失有助于阻挠往往组织在CRC类器官培养基中孕育。

表1. 东说念主和小鼠类器官培养基因素对比[1]

基于文件整理的CRC类器官的构建要领：

图1. CRC类器官构建要领表现图[2]

1. 现实前准备

主要试剂及仪器树立：生物安全柜，组织培养箱，离神思，细胞计数仪，显微镜，Matrigel，癌症干细胞（CSC）培养基，肿瘤解离液。

2. 组织赢得与处置

（1）样本赢得：从手术切除的未接纳过调养的CRC患者组织中赢得样本，需患者知情本旨及磋商伦理委员会批准。将簇新的原发性结直肠癌样本保存在预冷的PBS中，幸免冷冻。

（2）清洗组织：在超净职责台中，将肿瘤组织篡改至含有PBS的培养皿中，清洗2 - 3次，以去除血液和杂质。随后用CSC培养基再次清洗组织。

（3）剪碎组织：使用镊子和剪刀将肿瘤组织剪碎成约2mm大小的碎屑，尽量保证碎屑大小均匀，以加多细胞解离的恶果。

（4）消化组织：将剪碎的肿瘤组织篡改至肿瘤解离液中，于37°C孵育1h。工夫每隔15min，通过震荡或无菌吸管坎坷奏乐10-15次，以促进消化。

（5）过滤集会：消化后的组织悬液经70μm细胞筛过滤，再用1-2mL CSC培养基冲洗滤网，确保细胞充分集会。随后在4°C下450g离心5min，集会细胞千里淀。

3. 细胞区别与富集

（1）红细胞裂解：向细胞千里淀中加入5mL含0.8%（w/v）氯化铵和0.1 mM EDTA的溶液，冰上孵育10min，裂解红细胞。若红细胞裂解伪善足，可相宜加多氯化铵溶液体积并延伸孵育时候。

（2）去除死细胞：加入等体积的CSC培养基，在4°C下450g离心5min，弃上清。通过死细胞去除试剂盒，按照制造商的决策去除死细胞，得到活细胞悬液。

（3）细胞分选与培养：可通过流式细胞分选（FACS）富集CD133+肿瘤肇端细胞。将CD133+ 肿瘤细胞重悬于CSC培养基并计数，以5×10⁴ cells/mL的密度接种于非黏附培养瓶中，37°C、5% CO₂培养2周，直至出现多细胞蚁合体（类器官球）。

4. 类器官培养与守护

（1）类器官球培养：类器官球培养工夫，每3天更换一次CSC培养基。每周进行一次传代，若类器官球孕育过快，需提前传代。传代时，可遴荐机械奏乐或酶解的要领将类器官球解离成单细胞悬液。

（2）类器官培养：

① 单细胞悬液制备：将类器官球机械解离成单细胞悬液，进行细胞计数。若现实波及病毒载体转导操作，需在此体式前进行。

② Matrigel与细胞夹杂及铺板：以6孔板为例，将细胞稀释至合适浓度，与预冷的Matrigel按1:1比例夹杂均匀，快速吸取300μL夹杂液，滴加至6孔板的每个孔中心，防范操作幸免产不悦泡，使Matrigel团聚酿成穹顶结构。

③ 类器官酿成：向每个孔中牢固加入3mL CSC培养基，幸免冲散穹顶结构。将培养板放回培养箱继续培养，1-2周后可不雅察到类器官。

④ 类器官守护：按期不雅察类器官的孕育情况，左证培养基样式变化和类器官孕育现象，每2-3天更换一次培养基。当类器官孕育至合适大小或需要进行现及时，可进行后续操作，如药物处置、基因剪辑等。若需永久保存类器官，可将其冻存于液氮中，冻存液为含10% DMSO、30% KnockOut Serum Replacement 和 60% CSC培养基的夹杂液。

5. CRC类器官镜下形态图

图2. 结直肠癌类器官球[2]

图3. 原发性肿瘤相等繁衍的肿瘤类器官的H&E染色[3]

本期对于结直肠癌类器官的构建要领就先容结束，更多的细节世界不错再左证我方的现实蓄意来进一步完善。下期咱们将继续先容更多类器官的内容，敬请关爱小恒学术~

参考文件

[1] Barbáchano A, Fernández-Barral A, Bustamante-Madrid P, Prieto I, Rodríguez-Salas N, Larriba MJ, Muñoz A. Organoids and Colorectal Cancer. Cancers (Basel). 2021 May 28;13(11):2657.

[2] Bergin CJ, Benoit YD. Protocol for serial organoid formation assay using primary colorectal cancer tissues to evaluate cancer stem cell activity. STAR Protoc. 2022 Mar 4;3(1):101218.

[3] van de Wetering M, Francies HE, Francis JM, Bounova G, Iorio F, Pronk A, van Houdt W, van Gorp J, Taylor-Weiner A, Kester L, McLaren-Douglas A, Blokker J, Jaksani S体育游戏app平台, Bartfeld S, Volckman R, van Sluis P, Li VS, Seepo S, Sekhar Pedamallu C, Cibulskis K, Carter SL, McKenna A, Lawrence MS, Lichtenstein L, Stewart C, Koster J, Versteeg R, van Oudenaarden A, Saez-Rodriguez J, Vries RG, Getz G, Wessels L, Stratton MR, McDermott U, Meyerson M, Garnett MJ, Clevers H. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 2015 May 7;161(4):933-45.